تدوین نقشه ی مسیرهای تمایز سلول های بتا دانشمندان را به درمان های سلولی برای دیابت نزدیک تر کرد

جزایرلانگرهانس در پانکراس حاوی سلول های بتا(ترشح کننده انسولین) و سلول های آلفا(ترشح کننده ی گلوکاگون) می باشند. انسولین و گلوکاگون هورمون هایی هستند که برای تنظیم سطوح گلوکز در خون با هم همکاری می کنند. تخریب یا اختلال در سلول های بتا منجر به دیابت می شود. در حال حاضر هیچ درمانی وجود ندارد که بتواند مانع از پیشرفت دیابت و عوارض ناشی از آن شود. پیوند جزایر اغلب می تواند قند خون را به مدت چند سال به حالت عادی بازگرداند و از عوارض ثانویه ی دیابت در این مدت جلوگیری کند. با این حال، اهدا کنندگان پانکراس اندک هستند، و بهمین دلیل یافتن منابع دیگر برای جایگزینی سلول های جزایر ضروری است. در این رابطه سلول های بتای حاصل از سلول های بنیادی امیدوار کننده هستند. در این مقاله که در مجله ی Nature، توسط دکتر Veres و همکارانش منتشر شده است، نقشه ی مولکولی مراحل تمایز سلول های بنیادی به سلول های شبه جزایر ترسیم شده است. این تحقیق، اطلاعات شایان توجهی را برای تحقیقات آتی بمنظور تولید سلول های جزایر از سلولهای بنیادی برای پیوند ارائه نموده است.

سلول های بنیادی پرتوان القایی انسانی[1] می توانند به طور نامحدود خود را تجدید کرده و به هر نوع سلولی در بدن تبدیل شوند. بهمین دلیل، تلاش های بسیار زیادی در حال انجام است تا پروتکل های آزمایشگاهیبمنظور تولید سلول های جزایر تمایز یافته از سلول های بنیادی تدوین گردد. یک پروتکل ایده آل تمایز سلول های بنیادی به سلول هایα و سلول های بتای کاملا بالغ است که می تواند به محققان کمک کند که پس از تمایز، این سلولها را جدا کرده، تخلیص نمایند و دوباره به شکل ساختارهای خوشه ای(جزایر سلولی) برای پیوند به بیماران آماده کنند. برای رسیدن به چنین هدف بلند پروازانه ای، برنامه های تمایز همه ی سلول های جزایر و نحوه ی ساخت جزایر، باید بطور کامل درک شود.

دکتر Veres و همکارانش بیش از 100،000 سلول را در زمان های مختلف در طی تمایز سلول های بنیادی به سلول های پیش ساز پانکراس و سپس به سلول های تولید کننده هورمون (اندوکرین)، مورد آزمایش قرار دادند. توالی یابی RNAدرتک سلول( scRNA-seq[2]) در سلولهای نمونه برداری شده در هر مرحله از فرآیند تمایز انجام شد، و به دنبال آن تجزیه و تحلیل محاسباتی، امکان شناسایی انواع سلول ها و پیگیری دودمان آنها را در طی زمان تمایز فراهم نمود. نویسندگان به این ترتیب تصویری کامل از جزئیات نحوه ی تمایز سلول های پیش ساز پانکراس به دودمانهای مختلف سلولهای تمایز یافته، را تدوین کردند (شکل 1). رویکردهای فعلی برای تولید سلول های متمایز خاص از سلول های بنیادی، کارایی متغیری دارند، که عمدتا به دلیل ناهمگونی سلولی و کمبود دانش در مورد عوامل سیگنالینگ مولکولی مورد نیاز برای روند تمایز است. بنابراین، این نقشه ی راه از چگونگی تمایز سلول های جزایر در آزمایشگاه(in vitro)، اطلاعات لازم را برای تدوین پروتکل های تمایز آتی فراهم خواهد کرد.

شکل 1 : تمایز سلول های جزایر پانکراس انسانی در محیط آزمایشگاه. Veresو همکارانش تمایز سلول های پرتوان القایی (iPS) و یا سلول های بنیادی جنینی (ES) را در: سلول های پیش ساز پانکراس؛ سلولهای تولید کننده ی هورمون، سلول های آلفای مشتق شده از سلول های بنیادی (SC-α)، سلول های بتای مشتق شده از سلولهای بنیادی (SC-β) ، سلول های شبه انتروکرومافین (SC-EC)؛ و سلول هایی که هورمون تولید نمی کنند (سلول های غیر غدد درون ریز)، مطالعه کردند. نویسندگان با تعیین توالی دقیق RNAتک سلولی و تجزیه و تحلیل محاسباتی، انواع سلول هایی که در طول زمان ظهور می کردند، را شناسایی کردند. این کار به آنها برای توصیف روابط دودمان سلولی و مشخص کردن وضعیت بلوغ آنها کمک کرد. نویسندگان از مفهومی به نام pseudotimeبرای تعریف نحوه ی تغییر پروفایل بیان ژن در انواع سلول های مختلف در طی زمان تمایز استفاده کردند. آنها همچنین یک پروتکل تخلیص برای افزایش تعداد سلول های پیش ساز غدد درون ریز و سلول های بتا ایجاد کردند که یک قدم جلوتر از پروتکل های قبلا استفاده شده است. این مطالعه نشان می دهد که SC-αو SC-βمی توانند از سلول های بنیادی تخلیص شده و دوباره بشکل خوشه های سلولی یا جزایر سلولی دور هم جمع شوند و برای درمان جایگزینی سلول استفاده شوند.(برای دیدن شکل در ابعاد بزرگتر به آدرس منبع مراجعه نمایید)

 Veresو همکارانش دریافتند که سلول های پیش ساز پانکراس می توانند با بهره وری خوبی به سایر سلولها متمایز شوند. با این حال، سلول های پیش سازی که با ترکیبات اندکی متفاوت از عوامل سیگنالینگ تیمار شدند، نسبت های مختلفی از سلول های تولید کننده ی هورمون و سلولهایnon-endocrine  را ساختند. این نشان می دهد که این نسبتهای اندک متفاوت از عوامل سیگنالینگ( progenitor specification)، کلید تولید انواع دلخواه سلولهای تمایز یافته ی نهایی می باشد. در این تحقیق نویسندگان، سه نوع سلولی که فراوان ترین سلول های تولید کننده ی هورمون بودند: سلول های آلفا (SC-α)، سلول های بتا (SC-β) و سلول های شبه انتروکرومافین (SC-EC) مشتق شده از سلول های بنیادی، را مطالعه کردند. سلولهای انتروکروفامین معمولا در روده ظاهر می شوند و سروتونین تولید می کنند که به تنظیم حرکات روده و هضم کمک می کند.

جالب توجه است که SC-β که در غیاب عوامل سیگنالینگ خارجی تمایز یافته و به مدت پنج هفته رشد کرده خواص مولکولی و عملکردی تعریف شده ی خود را حفظ می کند. به طور خاص، این سلول ها ترشح مقدار ثابتی از انسولین را در پاسخ به تحریک گلوکز در طول این دوره نشان دادند. این مشاهدات نشان می دهد که واکنش به گلوکز یک مشخصه ی پایدار برای SC-β است که نیاز به فاکتور خارجی ندارد، بهمین دلیل SC-β برای غربالگری داروهای ضد دیابتی در آینده مناسب است.

نویسندگان همچنین مشاهده کردند که سلول هایی که هر دو هورمون جزایر یعنی انسولین و گلوکاگون را تولید می کنند، احتمالا SC-α نابالغ هستند، با توجه به مشخصات کلی بیان ژنی آنها که مشابه با سلول های آلفای انسان است. این سلول های چند هورمونی پس از پنج هفته کشت، به سلول های تک هورمونی که تنها گلوکاگون را تولید می کنند، تبدیل می شوند. این یافته در توافق با مشاهدات مطالعات قبلی است.

شناسایی SC-EC شگفت انگیز بود، زیرا سلولهای انتروکرومافین معمولا در پانکراس وجود ندارد. به طور مشخص، این سلول ها تا هشت هفته پس از پیوند به موش، پایدار باقی ماندند. نسبت SC-EC به سلول های غدد درون ریز پانکراس (SC-αو SC-β) به طور قابل ملاحظه ای تغییر کرد، زمانی که محققان کوکتل فاکتورهای سیگنالینگ داده شده به سلول ها را در مرحله ی تمایز تغییر دادند که با القا و طرحروده و پانکراس در موجود زنده مطابقت دارد. این مشاهدات نشان می دهد که جزئیات مشخصات سلول های پیش ساز پانکراس و روده، برای تولید سلول های اندوکرین مختص به یک ارگان ضروری است. ترکیبات مختلف فاکتورهای سیگنالینگ همچنین نسبت های مختلفی از سلول های غدد درون ریز و سلول های غیر غدد درون ریز(سلول های آسینار و داکتال پانکراس) را تولید می کنند.

برای تولید سلولهای جزایر بالغ، ایمن و کاربردی از سلول های بنیادی، زیرگروه های سلولی غدد درون ریز مورد نظر باید از هم جدا شده و تخلیص شوند و سپس بصورت جزایر کاذبی گردهم جمع شوند. نویسندگان دریافتند که یک روش ساده ی جداسازی و دور هم جمع شدن مجدد می تواند بیشتر سلول های غیر غدد درون ریز پرولیفراتیو را از محیط کشت خارج کند. علاوه بر این، محققان integrin α1 را به عنوان یک مولکول سطحی بیان شده توسط سلولهای SC-β شناسایی کردند. مرتب سازی سلول به روش مغناطیسی با استفاده از آنتی بادی integrin α1، نویسندگان را قادر ساخت تا کشت هایی حاوی 80 درصد سلول SC-β را بدست آورند.

القاء غدد درون ریز - شکل گیری انواع سلول های تولید کننده هورمون در پانکراس - گامی کلیدی در تمایز سلول های جزایر از سلول های بنیادی است. نویسندگان از طریق تجزیه و تحلیل بیان ژن در تقریبا 50،000 سلول منفرد توانستند تا روابط دودمانی(lineage relationships) بین سلول های پیش ساز پانکراس انسان و انواع سلول های تمایز یافته ی غدد درون ریز را با استفاده از یک رویکرد محاسباتی که قبلا توسعه یافته بود به نام pseudotemporal ordering(شکل 1) بازسازی کنند. این رویکرد همچنین ترتیب ظهور این نوع سلول ها و تغییرات مولکولی پویایی را که در طول هر مسیر تمایز رخ می دهد، مشخص نمود. سایر مطالعات از روش scRNA-seqو تجزیه و تحلیل محاسباتی برای تولید سریهای زمانی برای مدل سازی پویای جمعیت سلول های دخیل در فرایندهای رشد جنینی استفاده کردند. این روش ترکیبی می تواند برای بهینه سازی زمان بندی مراحل مختلف در پروتکل های تمایز استفاده شود.

چقدر ما به یک محصول درمانی برای جایگزینی سلولهای بتا نزدیک هستیم؟

هم اکنون یک کارآزمایی بالینی برای تست ایمنی و کارآیی پیوند سلول های پیش ساز پانکراس حاصل از سلول های بنیادی به افراد مبتلا به دیابت نوع 1، برای کنترل سطح قند خون (go.nature.com/2feyyud) در حال انجام است. با این حال، سلول های پیش ساز پانکراس پیوند شده هنوز نیاز به تمایز و بلوغ به سلول های بتا برای ترشح انسولین در پاسخ به تحریک گلوکز دارند. با توجه به این که ما نمی توانیم عوامل سیگنالینگ که در معرض سلولهای پیش ساز در موجود زنده( in vivo) قرار می گیرند را کنترل کنیم، مطلوب تر اینست که محصولی را تولید کنیم که انسولین را در پاسخ به گلوکز در زمانی که سلول ها هنوز در محیط کشت قرار دارند، تولید کند تا بمحض پیوند، بطور موثر عمل کرده و قند خون را کنترل کند. علاوه بر این، پیوند SC-β به تنهایی ممکن است برای درمان دیابت نوع 1 کافی نباشد، زیرا وجود سلول های αنیز برای کنترل صحیح ترشح هورمون از جزایر انسانی و برای تنظیم کلی مقادیر گلوکز ضروری است.

دکتر Veres و همکارانش تاکنون به پیشرفت های بزرگی برای رفع چندین مورد از این مشکلات دست یافته اند. آنها یک مجموعه داده های دقیق بوسیله ی scRNA-seq فراهم کردند که مراحل اصلی تمایز سلول های جزایر را در محیط آزمایشگاهی پوشش می دهد که برای مشخص کردن سلول های تولید شده در زمانی که عوامل سیگنالینگ در پروتکل های مختلف تغییر می کنند، مفید خواهد بود. یکی از یافته های اصلی مطالعه ی حاضر این است که SC-α و SC-β می توانند با هم تولید شوند، اما سلولهای SC-EC غدد درون ریز روده و سلول های پرولیفریتیو غیر غدد درون ریز نیز همزمان در این فرآیند تولید می شوند. این یافته ها، اطلاعات گرانبهایی را برای تولید یک محصول درمانی تعریف شده و مطمئن از SC-α و  SC-β که به سطح بالایی از خلوص نیاز دارد و حذف سلول های پیش ساز پرولیفراتیو برای جلوگیری از خطر ابتلا به سرطان، ارائه می دهد. در نهایت، تجزیه و تحلیل دقیق نویسندگان از داده های scRNA-seq منجر به شناسایی مارکرهای سطحی جدید و مسیرهای سیگنالینگ شد که به بهبود روش های تمایز سلول های جزایر و روش های خالص سازی آنها کمک می کند. به طور کلی، این مطالعه محققان را به سمت جایگزینی سلولهای بتا در کلینیک نزدیک تر کرده است.

منبع:

Nature 569, 342-343 (2019) doi: 10.1038/d41586-019-01211-9

https://www.nature.com/articles/d41586-019-01211-9